Introducción
Así como el ser humano ha tenido curiosidad del espacio sideral, preguntando y buscando respuestas a traves de la exploración espacial o la observacion con potentes telescopios, tambíen lo ha tenido para con la célula. Durante décadas se han desarrollado numerosas técnicas de microscopía de vanguardia para poder escudriñar las entrañas de las celulas en todo su esplendor y comprender mejor su funcionamiento.
Efectivamente, en los últimos años, las técnicas de obtención de imágenes de las células como la tomografía crioelectrónica (crio-ET) que permite a los investigadores ver las proteínas en las células en alta resolución, han comenzado a permitir a los científicos ver moléculas biológicas en sus entornos nativos. A diferencia de los métodos más antiguos que sacan proteínas individuales de sus nichos para estudiarlas, estas técnicas brindan una visión holística de las proteínas y otras moléculas junto con el paisaje celular. Aunque todavía tienen limitaciones, algunos investigadores dicen que la resolución de la crio-ET, por ejemplo, es demasiado baja para que las moléculas se puedan identificar con certeza, las técnicas están aumentando en popularidad y sofisticación. Los investigadores que recurren a ellos no solo quedan hipnotizados por las hermosas imágenes, sino que también quedan impresionados por algunos de los secretos que se están revelando, como los trucos que usan las bacterias para infectar células o cómo las proteínas mutadas impulsan enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson.
Los científicos han superado estos inconvenientes utilizando microscopía crioelectrónica (crio-EM), una técnica que revela la estructura de biomoléculas que han sido aisladas de su entorno y luego congeladas. Con cryo-EM, los científicos crean una imagen en 3D tomando fotografías en 2D de muchas moléculas aisladas en diferentes configuraciones y fusionando los resultados. Con cryo-ET, por el contrario, toman múltiples instantáneas de un solo trozo de material, repleto de moléculas, desde muchos ángulos diferentes, lo que permite que el entorno se mantenga intacto.
Es como tener una foto de toda una multitud, en lugar de la foto de una persona en la cabeza. Por eso Wolfgang Baumeister, biofísico del Instituto de Bioquímica Max Planck en Martinsried, Alemania, que es uno de los pioneros de la técnica, y sus colegas la han denominado “sociología molecular”.
Y así es como viven las proteínas, después de todo. “Las proteínas son sociales: en un momento dado, una proteína está en un complejo con unas diez proteínas más”, dice Villa. Después de ver tales interacciones con crio-ET, «no podía soportar la idea de estudiar otra proteína de forma aislada», agrega.
La tomografía electrónica en sí, el uso de un microscopio electrónico para obtener imágenes de una muestra desde varios ángulos, ha existido desde la década de 1960, pero no fue hasta la década de 1990 que el método comenzó a cobrar sentido. Uno de los desafíos fue que las corrientes de electrones son extremadamente dañinas para las muestras biológicas, lo que dificulta la captura de suficientes instantáneas para obtener una imagen clara y nítida. Los científicos han mejorado sus imágenes utilizando los últimos procesos de corte de muestras y métodos computacionales. Por ejemplo, una técnica llamada fresado con haz de iones enfocado en crio (crio-FIB) puede cortar muestras en rebanadas extremadamente delgadas conocidas como laminillas. Aún así, el costo y la experiencia técnica necesarios para usar cryo-ET, particularmente en combinación con métodos como el fresado cryo-FIB, pueden ser prohibitivos para muchos laboratorios, dice Baumeister.
Células sociables
Gran parte del trabajo inicial con crio-ET se realizó en procariotas: organismos unicelulares como las bacterias. Estas células suelen ser más pequeñas y delgadas que las células más complejas de los eucariotas.
En un estudio de Jensen de 2006, por ejemplo, él y su equipo informaron sobre la primera estructura completa del motor que impulsa el flagelo, un apéndice en forma de látigo en la bacteria [Murphy, GE, Leadbetter, JR y Jensen, GJ Nature 442 , 1062–1064 (2006)]. Usando cryo-ET, revelaron la arquitectura del motor de 20 piezas en Treponema primitia , una bacteria que se encuentra en los intestinos de las termitas, y detallaron cómo se colocaron estas partes en la membrana bacteriana. Jensen y sus colegas también han revelado detalles clave de pili bacterianos, protuberancias que los microorganismos usan para muchas funciones, como adherirse y secretar sustancias en las células que infectan. El año pasado, su equipo publicó un atlas digital de acceso abierto (consulte go.nature.com/3nugs7v ) en el que se destacan las muchas ideas que ha revelado cryo-ET sobre las células bacterianas y otras células procariotas.
Más recientemente, los científicos han pasado a obtener imágenes de células eucariotas, que son palaciegas en comparación con las procariotas. Esto ha sido posible en gran parte debido a la llegada del fresado crio-FIB, que permite a los investigadores cortar las células en rodajas finas antes de colocarlas bajo un microscopio electrónico. Baumeister y sus colegas utilizaron esta combinación de métodos para visualizar cómo se organizaron las moléculas en la vecindad del núcleo en una célula humana [Mahamid, J. y col. Science 351 , 969–972 (2016)]. Su trabajo reveló cómo filamentos nanométricos delgados, nunca antes vistos, proporcionaban soporte estructural al núcleo, convirtiéndolo en uno de los orgánulos más rígidos de las células animales.
Incluso con la molienda de FIB, cryo-ET puede capturar solo pequeños segmentos de células eucariotas, lo que significa que los científicos deben encontrar una manera de identificar moléculas de interés en un paisaje celular vasto y abarrotado. Una solución es seleccionar proteínas etiquetándolas primero con fluorescencia bajo un microscopio óptico y luego ampliando los detalles más finos en secciones específicas usando cryo-ET.
Villa y sus colegas han utilizado esta combinación de técnicas para resolver la arquitectura de LRRK2, una proteína vinculada a formas hereditarias de la enfermedad de Parkinson [Watanabe, R. y col. Cell 182 , 1508-1518 (2020)] . Su trabajo reveló que la versión mutada de la proteína se adhirió a componentes del citoesqueleto conocidos como microtúbulos, formando una doble hélice a su alrededor. Los hallazgos del equipo también insinuaron que el LRRK2 mutado podría formar una configuración que promueva este tipo de unión, lo que podría causar problemas al bloquear moléculas que transportan una carga celular importante a lo largo de los microtúbulos [Deniston, CK y col. Nature 588 , 344–349 (2020)].
Grupos como el de Baumeister han utilizado este método para examinar cómo las proteínas asociadas con enfermedades neurogenerativas como Huntington [Bäuerlein, FJB y col. Cell 171 , 179-187 (2017)] y la enfermedad de la motoneurona (esclerosis lateral amiotrófica o ELA) [Guo, Q. et al. Cell 172 , 696–705 (2018)], interactúan con componentes de la célula como el retículo endoplásmico (RE), un gran pieza de maquinaria celular que ayuda a sintetizar proteínas. Los investigadores han descubierto que los grupos neurotóxicos de proteínas implicadas en estas enfermedades se comportan de manera muy diferente entre sí dentro de las células. En Huntington, por ejemplo, los agregados de una forma mutante de una proteína llamada huntingtina parecen desorganizar la organización del RE, mientras que en la ELA, los agregados de una proteína anormal deterioran la bioquímica de la célula al activar su maquinaria de degradación de proteínas.
En el futuro, los científicos esperan utilizar estos métodos para comprender mejor cómo funciona la terapéutica, visualizando cómo actúan los fármacos en las entrañas moleculares de las células. En una demostración temprana, Julia Mahamid del Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania, y sus colegas pudieron vislumbrar antibióticos en una célula bacteriana que se une a los ribosomas, orgánulos que sirven como fábricas de proteínas [Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P. y Mahamid, J. Nature Methods 18 , 186-193 (2021)]. La hazaña fue posible al impulsar la resolución de cryo-ET a 3,5 ångströms.
Combinaciones poderosas
Cryo-ET es un campo de rápido crecimiento, pero la técnica todavía tiene una serie de limitaciones. La resolución sigue siendo un problema. Aunque el nivel de detalle ha mejorado drásticamente en los últimos años, cryo-ET no puede alcanzar la resolución a nivel atómico de cryo-EM. “Cryo-ET es donde estaba cryo-EM a principios de los 90, mucho antes de que pudiera lograr una resolución atómica”, dice Hong Zhou, biofísico de la Universidad de California en Los Ángeles.
En el nivel actual de rendimiento, es difícil identificar correctamente las moléculas en una célula usando cryo-ET, según Zhou. Entonces, a menos que los científicos estén mirando estructuras que previamente han sido bien caracterizadas, como el ribosoma, sus hipótesis sobre lo que ven con la técnica podrían resultar incorrectas, agrega. «Las probabilidades están en su contra. Es muy fácil cometer errores «.
Para eludir el problema de la resolución, Zhou ha optado por intentar superar los límites de la crio-EM convencional. Su equipo informó recientemente sobre un método llamado cryoID [Ho, C.-M. et al. Nature Methods 17 , 79–85 (2020)], que fusiona cryo-EM con varias otras técnicas. Uno de ellos implica romper las células abiertas en un método que permite que las proteínas permanezcan parcialmente dentro del medio celular original; de esta manera, los investigadores pueden ver las proteínas en un estado casi nativo. A pesar de su enfoque actual en cryo-EM, Zhou dice que cryo-ET es el futuro. «Considero [este método] un paso intermedio hacia ese objetivo».
Otra limitación de cryo-ET es su muestreo estrecho. “El secreto mejor guardado de la tomografía es que cuando miras una célula de mamífero, un tomógrafo es menos del 0,1% de esa célula”, dice Villa. Esto significa que los orgánulos grandes, como el núcleo, solo se pueden ver en pequeños segmentos. Para llenar este vacío, científicos como Harald Hess, biofísico del Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn, Virginia, están utilizando técnicas distintas de la crio-ET, a saber, microscopía de fluorescencia de súper resolución y microscopía electrónica, para visualizar células enteras. Usando estos métodos, Hess y sus colegas están obteniendo una nueva visión de cómo interactúan varios componentes celulares [Hoffman, DP y col. Ciencia 367 , eaaz5357 (2020)]. En un estudio publicado a principios de este mes, los investigadores demostraron que al utilizar el aprendizaje automático, una forma de inteligencia artificial, para ayudar a identificar estos componentes en muchas muestras, podían mapear la organización de hasta 35 tipos de orgánulos [Heinrich, L. et al. Naturaleza https://doi.org/10.1038/s41586-021-03977-3 (2021)] .
Otros investigadores están combinando crio-ET con otra técnica llamada tomografía de rayos X que puede capturar imágenes de células completas. Esto permite a los científicos examinar la estructura de componentes más grandes, como mitocondrias o núcleos, y luego ampliar áreas específicas de interés.
Sin embargo, reunir estos métodos requiere dinero y habilidad. Además de eso, ambas técnicas bombardean muestras con radiación dañina. Eso hace que sea un desafío transferir una muestra entre ellos, dice Eva Pereiro, científica de línea de luz en la instalación del sincrotrón ALBA en Barcelona, España, que produce rayos X adecuados para tomografía.
Algunos laboratorios ya han logrado esta hazaña. Maria Harkiolaki, científica principal de líneas de luz en Diamond Light Source, una instalación de sincrotrón en Didcot, Reino Unido, y sus colegas publicaron recientemente [Mendonça, L. et al. Nature Commun. 12 , 4629 (2021)] un modelo de la mecánica de la infección por SARS-CoV-2 que utiliza crioET y tomografía de rayos X para dilucidar el proceso. Capturaron eventos tanto a nivel celular como de moléculas individuales, y propusieron una idea de cómo se replica el virus en las células de los primates.
Baumeister cree que, al igual que la crio-EM, la crio-ET eventualmente permitirá a los científicos ver las moléculas biológicas en detalle atómico. Hasta entonces, los científicos continúan investigando con entusiasmo qué conocimientos sobre la célula podrían ser revelados por cryo-ET y otros métodos similares. Debido a que estas herramientas pueden revelar estructuras que nunca antes se habían visto, los investigadores a menudo se quedan con nuevos misterios por resolver. “Lo que me encanta de la tomografía”, dice Villa, “es que siempre generamos más preguntas que respuestas”.
FUENTE: Kwon, D. Nature 598 , 558-560 (2021). doi: https://doi.org/10.1038/d41586-021-02904-w